耐鎘菌株分離篩選及生物學研究

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摘要:探究尾礦污染土壤中耐鎘菌株的耐受性。利用含鎘LB液體培養基對菌株進行耐受性測試,篩選出4株耐受性較強的菌株;通過各耐鎘菌株的生長曲線、菌落特征和鎘去除率,確定菌J3為高效耐鎘菌株;該菌株在鹽濃度為1%,pH值為7.0時,生長狀況最佳。最佳生長條件下,該菌株對鎘的最大耐受濃度為400mg/L,最適耐受濃度為300mg/L。尾礦污染土壤中含有較豐富的耐鎘微生物資源,篩選出的高效耐鎘菌株耐受性較好,可為尾礦污染土壤的微生物修復提供可參考菌株。

關鍵詞:鎘;分離篩選;菌株;耐受性

隨著礦產資源的開發和金屬冶煉、工業廢水的排放以及化肥和農藥的過量或不合理使用,含鎘污染物通過各種途徑進入到環境,造成土壤的重金屬鎘污染。鎘具有毒性、難降解性,農業土壤被鎘污染后易通過食物鏈在動植物和人體內累計,直接威脅人類健康,必須采取一系列措施來治理重金屬污染土壤。土壤重金屬污染常見的修復方法有物理修復、化學修復及生物修復等,而生物修復中的微生物修復方法由于所需菌劑體量小、修復周期較短、無二次污染等特點受到廣泛關注。功能性微生物能夠通過吸附、氧化或還原重金屬,把有毒有害的重金屬轉化為無毒或低毒金屬沉淀物,并通過吸附實現重金屬的去除[1]。本研究從尾礦污染土壤中分離篩選出4株耐鎘功能性菌株,選取對鎘去除率最高的菌株,優化該菌株生長條件,確定其耐受性,為土壤中重金屬鎘的修復提供理論依據和可利用菌株資源。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1土樣來源

土樣采自選鐵完尾礦污染的土壤,全部研磨過60目篩后保存備用。

1.1.2培養基配方

LB液體培養基:胰蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g,氯化鈉5.0g,蒸餾水1000mL,pH值為7.0~7.2。LB固體培養基:胰蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g,氯化鈉5.0g,瓊脂粉15g,蒸餾水1000mL,pH值為7.0~7.2。1.2實驗方法

1.2.1耐鎘菌株的分離

取1.0g土樣于9mL無菌水中,充分混合后靜置30min,取1mL上清液加入到25mL的LB液體培養基中,30℃,150r/min振蕩培養2d[2]。1當培養基渾濁后取200μL加入到Cd2+濃度為50mg/L的液體培養基中進一步富集培養。以此類推,逐步增加培養基中的Cd2+濃度至200mg/L[3]。將Cd2+濃度為200mg/L的液體培養基稀釋,取稀釋倍數10-3,10-4,10-5的培養液依次涂布到LB固體培養基上進行耐鎘菌株的分離純化[4]。將平板上不同的單個菌落挑取至新的LB固體培養基平板上劃線培養,經過數次分離純化后得到純菌株。1.2.2高效耐鎘菌株的篩選挑取單個菌落接種到Cd2+濃度為200mg/L的LB液體培養基[5],30℃,150r/min振蕩培養24h制成種子液,并置于4℃冰箱備用。通過對幾種耐鎘單菌的菌落形態的觀察、生長曲線和鎘去除率的測定,篩選出最優菌株,確定為高效耐鎘菌株。

1.2.2.1耐鎘菌株菌落形態觀察

將菌株在LB固體培養基上進行稀釋涂布,在30℃恒溫培養箱中倒置培養1d后,觀察菌落形態、大小和邊緣形狀等。

1.2.2.2耐鎘菌株生長曲線的測定

以1%接種量接種到Cd2+濃度為200mg/L液體培養基中,30℃,150r/min振蕩培養56h,延遲期每1h一測,對數期后每4h一測。最后以培養時間為橫坐標,以培養菌株OD600為縱坐標,繪制菌株生長曲線。實驗空白為未接種的培養基。1.2.2.3耐鎘菌株對鎘去除率的測定培養條件同1.2.2.2,培養時間為72h,每24h取樣測鎘去除率。樣品以6000r/min離心10min,待沉淀完全后取上清液,按照《水質銅、鋅、鉛、鎘的測定原子吸收分光光度法》(GB7475—87)[6]進行測定。去除率(P):P=(C0-C1)/C0×100%式中:C0———樣品Cd2+初始濃度,mg/L;C1———樣品經耐鎘菌株去除后Cd2+濃度,mg/L。

1.2.3生長條件對高效耐鎘菌株生長的影響

1.2.3.1鹽濃度對高效耐鎘菌株生長的影響為避免其他無機鹽離子對菌株生長造成影響,探究鹽濃度對高效耐鎘菌株生長的影響實驗中,鹽濃度調節采用NaCl,這與LB液體培養基中無機鹽離子種類一致。取種子液0.5mL接種于50mLNaCl濃度分別為0%,0.5%,1%,2%,4%,5%的LB液體培養基中,30℃,150r/min恒溫振蕩培養36h,取樣測定OD600值。

1.2.3.2pH值對高效耐鎘菌株生長的影響

為避免其他鹽離子對菌株生長的影響,探究pH值對高效耐鎘菌株生長的影響實驗中,pH值調節采用HCl和NaOH,這與LB液體培養基中無機鹽離子種類一致。取種子液0.5mL接種于50mLpH值分別為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0的LB液體培養基中,30℃,150r/min恒溫振蕩培養36h,取樣測定OD600值。1.2.4高效耐鎘菌株對鎘的耐受性實驗在最佳生長條件下,將高效耐鎘菌株接種到Cd2+濃度分別為200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的LB液體培養基中,最佳鹽濃度和pH值下,30℃,150r/min振蕩培養56h。

2結果與分析

2.1高效耐鎘菌株的篩選結果

2.1.1不同耐鎘菌株菌落形態差異經過富集培養、分離純化,篩選出4種對Cd2+具有較高耐性的菌株,分別編號為J1、J2、J3和J4。各菌株菌落形態如圖1所示,菌落特征差異2.1.2不同耐鎘菌株生長曲線差異對四種耐鎘菌株進行生長曲線的測定,結果如圖2所示。由圖2可知,各菌株Cd2+濃度為200mg/L的液體培養基均可正常生長,0~8h內處于延遲期;8~16h處于對數生長期;16~44h處于穩定期;培養44h后,各菌株開始進入衰亡期。2.1.3不同耐鎘菌株對鎘的去除率不同耐鎘菌株對鎘的去除效果如圖3所示,去除速率見圖4。由圖3、圖4可知,0~24h,J1和J4去除速率較快,各菌株去除速率均大于1.10%/h,24h時,對鎘的去除率分別達到了41.6%和36.3%,而J2、J3對鎘去除率分別為27.2%,26.3%;24~48h之間,J2和J3對鎘的去除速率加快,分別為0.96%/h和1.13%/h,遠超過J1、J4的0.09%/h和0.31%/h,48h時,J2和J3鎘去除率分別達到了50.2%和53.5%,而J1和J4的去除率均為43.8%;48~72h之間,各菌株對鎘的去除速率均減慢,最快的為J2和J3,但去除速率只有0.14%/h,而J1和J4無增長,72h時,對鎘的去除率最高的菌株為菌3達56.9%,J1、J2和J4分別為43.3%,53.5%和43.9%各菌株對鎘去除速率變化規律與2.1.2中各菌株生長時期出現時間一致,0~24h,各菌株陸續從對數生長期進入到穩定期,菌株數量大幅度增長,對Cd2+需求量迅速變大,此期間各菌株對鎘的去除速率最大;24~48h,各菌株基本處于穩定期,此階段各菌株基數最大,J2和J3仍以較大速率去除鎘,且貢獻將近一半的去除率,而J1和J4可能受培養基中營養物質消耗、毒性產物積累等不利因素的影響較大,對鎘的去除速率大幅降低;48~72h,各菌株處于衰亡期,菌株數量急劇下降,活性降低,對鎘的去除速率減慢,甚至不再去除。綜合各菌株菌落形態、生長曲線和鎘去除率可知,J3在含鎘200mg/L的液體培養基中生長最好,鎘去除率最高,確定為高效耐鎘菌株,后續實驗將對該菌株作進一步研究。

2.2高效耐鎘菌株最佳生長條件的確定

微生物吸附重金屬的過程與菌體的生長代謝密切相關,菌體的正常生長是高效富集去除重金屬離子的保證。微生物生長過程中受外界環境影響,若培養條件適宜,微生物就可正常生長,反之則會使生長受到抑制甚至變異或死亡。因此,確定菌體的最佳生長條件,對菌株是否能高效去除重金屬離子至關重要。

2.2.1不同鹽濃度對高效耐鎘菌株生長的影響

培養基中鹽濃度會影響菌體細胞滲透壓高低,體系中鹽濃度過高時,菌體會處于高滲透壓環境下,受Na+作用,細胞就會失水收縮,使菌株生長受到抑制,不同微生物對滲透壓的適應能力參差不齊[7]。不同鹽濃度對高效耐鎘菌株生長的影響如圖5所示。由圖5可知,在鹽濃度為1%時,菌體OD600為1.749,高效鎘去除菌菌株生長情況最好;鹽濃度低于1%時,菌體OD600最低為1.651,菌株生長所受影響不大;高于1%時,隨著鹽濃度增加,體系滲透壓增大,菌株生長逐漸受到影響,菌體OD600從1.709降至1.415。因此,高效耐鎘菌株最佳生長鹽濃度為1%。2.2.2不同pH值對高效耐鎘菌株生長的影響菌體生長過程中機體內時刻發生酶促反應,而pH值會直接影響菌株相關代謝酶的活性,只有在適宜pH值范圍內酶促反應速率才能達到最高,最有利于重金屬離子吸附去除,過低或過高的pH值都會使菌體生長受到抑制[8]。不同pH值對高效耐鎘菌株生長的影響如圖6所示。由圖6可知,隨pH值升高,菌株生長量呈現出先增加后降低的趨勢。當在pH值為7.0時,高效耐鎘菌株在液體培養基中的生長狀況最好。因此,高效耐鎘菌株最佳生長pH值為7.0。2.3最佳生長條件下高效耐鎘菌株對鎘的耐受性在最佳生長條件下,即鹽濃度1%、pH值7.0時,測定高效耐鎘菌株對鎘的耐受性,結果如圖7所示。由圖7可知,當液體培養基Cd2+濃度為200mg/L、250mg/L、300mg/L時,菌株生長曲線相差不大,進入對數生長期時,菌體OD600分別為0.134,0.130,0.100,進入穩定期時菌體OD600分別為1.458,1.449,1.376,說明Cd2+濃度在小于300mg/L時對高效耐鎘菌株生長影響不大;當Cd2+濃度為400mg/L時,高效耐鎘菌株在培養基中的生長量顯著下降,但生長規律符合該菌株生長曲線;Cd2+濃度為500mg/L時,培養基中的菌株幾乎不生長,無明顯生長規律,這是由于重金屬Cd2+毒性較大,高濃度Cd2+產生的毒性抑制了菌株生長[8]。以上結果表明,高效耐鎘菌株對鎘耐受性較強,對鎘的最大耐受濃度為400mg/L,最適耐受濃度為300mg/L

3結果與討論

具備重金屬耐受性菌株的篩選是研究微生物修復的重要環節,當前從重金屬污染土壤中分離篩選菌株是最有效的途徑之一。本研究從尾礦污染土壤中分離篩選出4株耐鎘菌株,菌株均可在Cd2+濃度為200mg/L的液體培養基中生長,充分說明尾礦污染土壤中存在較為豐富的耐鎘微生物資源;并且菌J3生長最好,對鎘去除率最高,達到了56.9%,確定菌J3為高效耐鎘菌株。高效耐鎘菌株最佳生長鹽濃度為1%,最適生長pH值為7.0;最佳生長條件下,高效耐鎘菌株對鎘的最大耐受濃度為400mg/L,最適耐受濃度為300mg/L,說明高效耐鎘菌株具有較強的耐鎘性。本研究篩選出的高效耐鎘菌株對重金屬Cd耐受性較好,可作為試驗材料之一應用于重金屬鎘污染的微生物修復,為Cd污染土壤的微生物修復提供了可利用的菌株資源。下一步需對高效耐鎘菌株進行分子鑒定,探明菌屬,方便研究應用;另外挖掘合適的載體和介質,使得施加到土壤中的菌株可最大限度地發揮其對金屬的固定作用。

參考文獻

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作者:張晨 郭愛紅 單位:河北環境工程學院學報